Mediálne centrum / Publikovaná literatúra

Autor: Ding Huang, Wen-Juan Peng, Qian Ye, Xu-Ping Liu, Liang Zhao, Li Fan, Kang Xia-Hou, Han-Jing Jia, Jian Luo, Lin-ting Zho.
PLOS One, 2015, 10 (11): E0141686

Abstraktný
Vývoj procesov bunkovej kultúry suspenzie bez séra je veľmi dôležitý pre produkciu vakcíny proti chrípke. Predtým sme vyvinuli bunkovú líniu suspenzie MDCK v médiu bez séra. V tejto štúdii sa skúmalo rastová kinetika suspenzných MDCK buniek a produkcie vírusu chrípky v médiu bez séra v porovnaní s kilikami adherentných MDCK buniek v médiu obsahujúcich séra aj v sére. Zistilo sa, že médium bez séra podporovalo stabilnú subkultúru a rast adherentných aj suspenzných buniek. V šaržovej kultúre, pre obe bunkové línie, bola rastová kinetika v médiu bez séra porovnateľná s tými v médiu obsahujúcom séra a komercializovaného média bez séra. V médiu bez séra, maximálna životaschopná hustota buniek (VCD), hemaglutinín (HA) a mediánová tkanivová kultúra infekčná dávka (TCID₅₀) Titre dvoch bunkových línií dosiahli 4,51 × 10⁶bunky/ml, 2,94log₁₀(Hau/50 μl) a 8,49log₁₀(Vióny/ml) a 5,97 × 10⁶bunky/ml, 3,88log₁₀(Hau/50 μl) a 10,34log₁₀(Vióny/ml), respektíve. Zatiaľ čo vírus výťažok adherentných buniek v médiu bez séra bol podobný výťažku v médiu v sérum, v sérovej kultúre v sére-freemediumshow bol vyšší výťažok vírusu ako adherentné bunky v médiu obsahujúcich sérum a suspenzné bunky v komerčenom médiu bez séra. Percento infekčných vírusov však bolo nižšie pre kultúru suspenzie v sére-freemedium. Tieto výsledky demonštrujú veľký potenciál tejto bunkovej línie MDCK v médiu bez séra na výrobu vakcíny proti chrípke a sú opodstatnené ďalšie zlepšenia.

Autor: Luo Jian, Liu Xu-Ping, Xiong Fei-Fei, Gao Fei-Xia, Yi Ying-Lei, Zhang Min, Chen Ze, Tan Wen-Song.
Frontiers in Immunology, 2019, 10: 2274

Abstraktný
Vakcíny proti chrípke pre podtyp H7N9 preukázali nízku imunogenitu v klinických skúškach u ľudí. Použitie nových adjuvantov môže predstavovať optimálnu dostupnú možnosť pri vývoji vakcíny. V tejto štúdii sme demonštrovali, že použitie agonistického CGAMP Sting ako sliznice je účinné pri zvyšovaní humorálnych, bunkových a mukóznych imunitných reakcií celého vírusu, inaktivovanej vakcíny H7N9 u myší. Jedna dávka imunizácie bola schopná úplne chrániť myši pred vysokými smrteľnými dávkami homológneho vírusového výzvy s významným účinkom šetriacim dávkou. Zistili sme tiež, že intranazálne spoločné podávanie vakcíny H7N9 s CGAMP by mohlo poskytnúť účinnú krížovú ochranu proti vírusu chrípky H1N1, H3N2 a H9N2. Ďalej CGAMP indukoval významne vyššiu nukleoproteín špecifickú pre CD 4+ a CD 8+ T buniek reakcie u imunizovaných myší, ako aj zvýšenú expresiu IFN-G a granzyme B v pľúcnom tkanive MICE v skorých štádiách po heterosubickom vírusovom výziev. Tieto výsledky naznačili, že agonista Sting Agonist CGAMP bude účinným slizým imunitným adjuvansom pre predpandemické vakcíny, ako sú vakcíny proti H7N9, a sľubnou stratégiou vakcíny proti inaktivovanej inaktivovanej inaktivovanej vakcínom CGAMP bude tiež sľubnou stratégiou vakcíny proti vakcínom so širokopásmom.

Autor: Thomas Bissinger, Johannes Fritsch, Adrian Mihut, Yixiao Wu, Xuping Liu, Yvonne Genzel, Wen-Song Tan, Udo Reichl.
Vaccine, 2019, 37 (47): 7003-7010

Abstraktný
Kontrola a prevencia rýchleho šírenia chrípky medzi ľuďmi závisia od dostupnosti účinných a bezpečných sezónnych a pandemických vakcín, ktoré sa uskutočnili predovšetkým z inaktivovaných častíc vírusu chrípky. Súčasné procesy produkcie vírusu chrípky sa vo veľkej miere spoliehajú na embryonované kuracie vajcia alebo na bunkovú kultúru ako substrát na šírenie vírusov. Dnešné úsilie o intenzifikáciu procesu v kultúre živočíšnych buniek by mohlo inovovať výrobu vírusovej vakcíny s použitím vysokovýkonných suspenzných buniek v procesoch perfúznej hustoty s vysokou hustotou buniek. V tejto práci uvádzame bunkovú líniu MDCK prispôsobenú na rast ako suspenzia s jednou bunkou s časom zdvojnásobenia menej ako 20 hodín, čím sa dosiahne koncentrácie buniek nad 1 × 10⁷Bunky/ml v dávkovom režime. Titer vírusu chrípky A získaný v dávkových infekciách bol 3,6 log₁₀(Hau/100 ml) pre celkové a 10⁹Vióny/ ml pre infekčné vírusové častice (TCID₅₀), respektíve. V koncentráciách poloperfúzneho režimu do 6 × 10⁷bunky/ml, akumulovaný vírusový titer 4,5 log₁₀(Hau/100 ml) a infekčný titer takmer 10¹⁰virióny/ml (TCID₅₀) boli možné. To prevyšuje výsledky uvedené predtým uvádzané pre šírenie vírusu chrípky založeného na bunkovej kultúre zďaleka a navrhuje perfúzne kultúry ako preferovanú metódu pri výrobe vírusovej vakcíny.

Autor: Yixiao Wu, Hanjing Jia, Xuping Liu, Wen-Song Tan.
Bioresources and BioProcessing, 2020, 7: 63

Abstraktný
Použitie vakcín proti vtáčej chrípke H9N2 podtypu je účinným prístupom pre kontrolu vírusu šíreného medzi hydinou a na modernizáciu výroby vakcíny by výrobná platforma založená na bunkovej kultúre mohla prekonať obmedzenia konvenčnej platformy založenej na vajec a striedať sa. Vývoj bunkovej kultúry suspenzie bez séra by mohol umožniť ešte vyššiu produktivitu vírusu, kde sa vyžaduje bunková línia suspenzie s dobrým výkonom a správny kultúrny stratégie. V tejto práci bola adherentná bunková línia obličiek psieho psieho psu (MDCK) prispôsobená rastu suspenzie na koncentráciu buniek až do 12 x 10⁶Bunky/ml v médiu bez séra v dávkových kultúrach. Následne sa hodnotil propagácia vírusu chrípky H9N2 v tejto bunkovej línii MDCK s optimalizáciou infekčných podmienok z hľadiska MOI a koncentrácie buniek na infekciu. Ďalej boli v infekčnej fáze testované rôzne stratégie krmiva na zlepšenie titer vírusu a maximálny titer hemaglutinínu 13 log₂(Hau/50 μl) sa získal pomocou stratégie riedenia 1: 2. Hodnotenie rastu buniek MDCK a produkcie vírusu H9N2 v bioreaktoroch s optimalizovanými prevádzkovými podmienkami ukázalo porovnateľnú výkonnosť buniek a výťažok vírusu v porovnaní s trasenými bitkami, s vysokým výťažkom vírusu špecifického pre bunky nad 13, 000 viriónmi/bunkami. S purifikovaným vírusom H9N2 zozbieraním z bioreaktorov bola vakcína odvodená od MDCK schopná indukovať vysoké titre neutralizujúcich protilátok u kurčiat. Výsledky celkovo demonštrujú sľubnú aplikáciu vysoko účinnej výrobnej platformy založenej na MDCK bunka pre výrobu vakcíny proti chrípke vtákov.

Autor: Yixiao Wu, Xuping Liu, Udo Reichl, Wen-Song Tan.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2021, 105 (4): 1-14

Abstraktný
Podobne ako v prípade nedávneho covidu -19 pandemiky, vírus chrípky A predstavuje pre globálnu komunitu neustálu hrozbu. Na liečbu chrípkového ochorenia sú k dispozícii antivirály aj vakcíny s vakcínami najúčinnejším a najbezpečnejším prístupom. S cieľom prekonať obmedzenia vo výrobe vakcíny na báze vajec boli stanovené procesy bunkovej kultúry založené na kultúre. Aj keď sa táto výrobná metóda vyhýba rizikám spojeným s vajecmi tvárou v tvár pandémii, intenzifikácia procesu pomocou buniek suspenzie zvierat v kultúrach s vysokou hustotou buniek by mala umožniť ďalšie zvyšovanie výrobných kapacít na celom svete. V tejto práci demonštrujeme vývoj perfúzneho procesu s použitím suspenzných buniek obličiek Madin-Darby Canine (MDCK) na produkciu vírusu chrípky A (H1N1) od kultivácie fľašky v mierke dole až po laboratórne bioreaktory s rozruchmi. Kultivácie Flask Flask pomocou polo-perfúzneho režimu povolené zbery vírusu s vysokým výnosom (4,25 log₁₀(Hau/100 μl)) z buniek MDCK sa rozrástli na 41 x 10⁶Bunky/ml. Rozšírenie na bioreaktory so striedavým perfúznym systémom Tancigence Flow (ATF) si vyžadovalo optimalizáciu regulácie pH a implementáciu teplotného posunu počas fázy infekcie. Použitie sondy kapacity na kontrolu online perfúzie umožňuje minimalizovať strednú spotrebu. To prispelo k lepšej kontrole procesu a ekonomickejšiemu výkonu pri zachovaní maximálneho titer vírusu 4,37 log₁₀(Hau/100 μl) a infekčný titer vírusu 1,83 × 10¹⁰Vióny/ml. Celkovo táto štúdia jasne demonštruje nedávny pokrok v perfúznych procesoch založených na bunkovej kultúre pre výrobu vakcíny proti chrípke s vysokým výnosom pre výrobu vakcíny proti chrípke na pandémiu.

Autor: Thomas Bissinger, Yixiao Wu, Pavel Marichal-Gallardo.
Biotechnologia a bioinžiniering, 2021, 118 (10): 3996-4013

Abstraktný
Sezónne epidémie chrípky sa vyskytujú každý rok v severnej aj južnej pologuli. Napriek rozdielom v povrchových antigénoch vírusu chrípky a virulencii sezónnych podtypov sú výrobcovia dobre prispôsobení, aby reagovali na tento periodický dopyt po vakcíny. V dôsledku desaťročí výskumu vírusu chrípky je vývoj nových vakcín proti chrípke relatívne priamy. V podobnosti s prebiehajúcou koronavírusovou chorobou 2019 je výroba vakcíny hlavným problémom pre rýchlu ponuku miliárd dávok požadovaných na celom svete. Je potrebné naplánovať najmä výrobu vakcíny na báze vajec a je potrebné predvídať aj nedostatok iných vakcín na báze vajec s vysokými požiadavkami. Výrobné systémy založené na bunkovej kultúre umožňujú výrobu veľkého množstva vakcín v krátkom časovom rámci a významne rozširujú naše možnosti reagovať na pandémiu a vznikajúce vírusové choroby. V tejto štúdii uvádzame integrovaný proces na produkciu inaktivovaného vakcín proti vírusu chrípky A založeného na bunkovej línii suspenzie psov Madin-Darby (MDCK) kultivovanej v chemicky definovanom médiu. Veľmi vysoké titre 3,6 denníka₁₀(Hau/100 UL) sa dosiahli pomocou rýchlo rastúcich MDCK buniek pri koncentráciách do 9,5 x 10⁶Bunky/ml infikované vírusom chrípky A/PR/8/34 H1N1 v 1 L miešaných bioreaktoroch. Kombinácia membránovej stericexklúznej chromatografie, po ktorej nasledovala pseudo-afinitná chromatografia so sulfáciou celulózovej membránovej adsorber, umožnila úplné zotavenie pre krok zachytenia vírusov a až 80% zotavenia pre krok leštiaceho vírusu. Purifikované vírusové častice vykazovali homogénnu distribúciu veľkosti s priemerným priemerom 80 nm. Na základe monovalentnej dávky 15 ug hemaglutinínu (jednorazová imunodifúzna test) bola hladina celkovej proteínovej a hostiteľskej bunkovej DNA 58 ug a 10 ng. Okrem toho môžu byť všetky kroky procesu úplne zmenšené na priemyselné množstvá pre komerčnú výrobu vakcín proti sezónnym alebo pandemickým chrípkovým vírusom. Rýchla produkcia až 300 dávok vakcín na liter v rámci 4-5 robí tento proces konkurencieschopným nielen iným procesom na báze buniek, ale aj pre procesy založené na vajciach.

Autor: 5. Qian Ye, Xuping Liu, Yuxiang Wan, Wen-Song Tan, Liang Zhao.
Biologics, 2022, 80: 35-42

Abstraktný
Chrípka je globálnym problémom v oblasti verejného zdravia, ktorý vedie k rozsiahlej chorobnosti a úmrtnosti s ničivou ekonomickou stratou ročne. Bunková línia Madin-Darby Canine Cidney (MDCK) bola hlavnou bunkovou líniou pre aplikácie vakcíny proti chrípke. Aj keď bolo zdokumentovaných veľa podrobností o metabolických reakciách hostiteľa na infekciu vírusom chrípky A (IAV), o metabolických preprogramovacích funkciách hyperproduktívneho hostiteľa na produkciu vakcíny IAV. V tejto štúdii sa ukázalo, že klon bunkového klonu MDCK má osobitnú vysokú produktivitu 30 x 10³Vióny/bunka. Hodnotil sa metabolizmus glukózy a aminokyselín H1, čo naznačuje, že vysoký producent mal konkrétny fenotyp metabolického preprogramovania v porovnaní s jej rodičovskou bunkovou líniou (P): zvýšenú absorpciu glukózy, vynikajúci tok cyklu trikarboxylového kyseliny, mierna konzumácia aminokyselín a lepšia regulácia reaktívnych druhov oxygénu. V kombinácii so silnejšou mitochondriálnou funkciou a miernymi antivírusovými a zápalovými reakciami charakterizovanými predtým naše výsledky naznačujú, že vysoký producent mal dostatočný intracelulárny dodávok energie a vyváženú distribúciu substrátov pre syntézu IAV a hostiteľských proteínov, ako aj intracelulárny redoxný stav. Pochopenie týchto metabolických zmien pripravuje cestu pre vývoj racionálnej bunkovej línie a primeranú optimalizáciu procesu pre produkciu vakcíny proti chrípke s vysokým výnosom.

Autor: Jiaqi Wang, Chen Wang, Li Fan, Liang Zhao, Wen-Song Tan.
Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2019, 411 (13): 2971-2979

Abstraktný
Bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) prevládajú pri produkcii terapeutických proteínov na liečbu rôznych chorôb. Charakterizácia a skúmanie metabolizmu buniek CHO rýchlym a jednoduchým spôsobom by mohlo zvýšiť vývoj procesu a bunkovej línie. Preto bola vyvinutá metóda na súčasnú detekciu siedmich metabolitov súvisiacich s redoxom a energiou v bunkách CHO kapilárnou elektroforézou. Na zlepšenie tvaru a rozlíšenia maximálneho rozlíšenia sa použila technika zaostrenia online pomocou 5 0 μm × 44 cm nepotiahnutého fúzovaného oxidu kremičitého. Kľúčové parametre a ich interakcie sa skúmali návrhom experimentov (DOE) a optimalizované podmienky boli stanovené funkciou vhodnosti nasledovne: 24 stupňov, 95 mm a pH 9,4 BGE. Táto metóda bola overená na zabezpečenie citlivosti, linearity a reprodukovateľnosti. Limity detekcie (LODS) sa pohybovali od 0. Relatívne štandardné odchýlky (RSD) času migrácie a plocha vrcholu boli menšie ako 0,872%a 5,5%, s výnimkou NADPH a výťažky boli medzi 97,5 a 101,2%. Táto metóda sa úspešne použila na analýzu extraktov z buniek CHO za dvoch rôznych kultivačných podmienok.

Autor: Christopher S. Stach, Meghan G. McCann, Conor M. O'Brien, Tung S. Le, Nikunj Somia, Xinning Chen, Kyoungho Lee, Hsu-Yuan Fu, Prodromos Daoutidis, Liang Zhao, Wei-Shou Hu, Michael Smanski.
ACS Syntetic Biology, 2019, 8, 11: 2524-2535

Abstraktný
Čínske vaječníky škrečkov (CHO) sa používajú na priemyselnú produkciu terapeutík na báze proteínov (tj biologicko). Tu popisujeme metódu kombinácie kinetických modelov na úrovni systémových úrovní so syntetickou biologickou platformou pre viactigénnu nadmernú expresiu na racionálne narušenie glykozylácie prepojenej N. Konkrétne sme sa snažili zvýšiť inkorporáciu galaktózy na sekretovanom imunoglobulínovom G (IgG) proteíne. Racionálne navrhujeme, staviame a testujeme celkom 23 transgénnych bunkových bazénov, ktoré exprimujú jednotlivé alebo trojgénové glycoinžinujúce kazety obsahujúce celkom 100 kilobáz inžinierovanej sekvencie DNA. Prostredníctvom iteračného inžinierstva a vylepšenia modelu racionálne zvyšujeme frakciu bigalaktozylovaných glykánov päťkrát z 11,9% na 61,9% a súčasne znižujeme heterogénnosť glykánu na sekretovanom IgG. Náš prístup umožňuje rýchle testovanie hypotéz a identifikáciu synergického správania z genetických porúch premostením systémami a syntetickou biológiou.

Autor: Liang Zhao, Hsu-Yuan Fu, Ravali Raju, Nandita Vishwanathan, Wei-Shou Hu.
Biotechnológia a bioinžinierstvo. 2017, 114 (7): 1583-1592

Abstraktný
V posledných niekoľkých rokoch sa analýza transkriptómu čoraz viac používa na lepšie pochopenie fyziológie buniek vaječníkov čínskych škrečkov (CHO) na globálnej úrovni. Keď sa akumulovali viac transkriptómových údajov, metaanalýza na súboroch údajov zozbieraných z rôznych zdrojov môže potenciálne poskytnúť lepšie informácie o bežných vlastnostiach týchto buniek. Tu sme vykonali metaanalýzu na transkriptomálnych údajoch rôznych CHO bunkových línií získaných pomocou platforiem Nimblegen alebo Affymetrix Microarray. Hierarchické zhlukovanie, analýza negatívnej matricovej faktorizácie (NMF) a analýza hlavných komponentov (PCA) podľa všetkého ukázali, že vzorky boli zhlukované do dvoch skupín: jedna pozostáva z adherentných buniek v médiu obsahujúcich sérum a ostatné suspenzné bunky v médiu bez séra. Gény, ktoré boli diferencovane exprimované medzi týmito dvoma zhlukami, boli obohatené v niekoľkých funkčných triedach databázou na anotáciu, vizualizáciu a integrované objavovanie (David), z ktorých mnohé boli spoločné s obohatenými génovými množinami identifikovanými génovou analýzou obohatenia génov (GSEA), vrátane extracekulárnych matrixov (ECM) receptorových interakcií, recepčných recepčných recepčných recepčných recepčných recepčných recepčných receptov, apidov. Napriek heterogénnym zdrojom vzoriek buniek sa zdá, že adherentné charakteristiky rastu a dodržiavanie suspenzie a dodávka séra sú dominantným znakom v transkripte. Výsledky ukázali, že metaanalýza transkriptómu by mohla odhaliť funkcie v kombinovaných súboroch údajov, ktoré jednotlivé súbory údajov nemusia odhaliť. Keď sa súbor transkriptómových údajov hromadí v priebehu času, metaanalýza sa stane ešte viac odhaľujúcou.

Autor: Arpan A. Bandyopadhyay, Sofie A. O'Brien, Liang Zhao, Hsu-Yuan Fu, Nandita Vishwanathan, Wei-Shou Hu.
Biotechnology and BioEngineering, 2019, 116 (1): 41-53

Abstraktný
Čínske vaječníky škrečkov, bežne používané pri produkcii terapeutických proteínov, sú aneuploid. Ich chromozómy nesú štrukturálnu abnormalitu a podliehajú zmenám v štruktúre a počte počas proliferácie buniek. Niektoré výrobné bunkové línie sú nestabilné a strácajú svoju produktivitu v priebehu času vo výrobnom procese a počas životného cyklu produktu. Aby sa lepšie porozumelo prepojeniu medzi genomickými štrukturálnymi zmenami a stabilitou produktivity, imunoglobulín G produkujúca bunková línia bola postupne klonovaná klonovaná na získanie subklonov, ktoré si zachovali alebo stratili produktivitu, a ich genomické vlastnosti sa porovnali. Aj keď každý subklon začal jediným karyotypom, potomstvo sa rýchlo diverzifikovalo na populáciu s distribúciou chromozómových čísel, ktoré nie sú odlišné od rodiča a medzi subklonmi. Porovnávacia analýza genómovej hybridizácie (CGH) ukázala, že rozsah variácie kópií génových kódovacích oblastí medzi rôznymi subklonmi zostal na úrovniach niekoľkých percent. Genómové oblasti, ktoré boli náchylné na stratu kópií, vrátane jedného s miestom integrácie transgénu produktu, boli identifikované v CGH. Strata kópie transgénu bola sprevádzaná stratou úrovne trangénového prepisu. Sekvenčná analýza buniek hostiteľských buniek a buniek produkujúcich rodičovské bunky vykazovala významné štrukturálne variácie v regiónoch náchylných na stratu kópií. Celkovo sme demonštrovali prechodnú povahu klonálnej homogenity vo vývoji bunkových línií a zadržanie distribúcie počtu chromozómov populácie; Ďalej sme preukázali, že štrukturálne variácie v oblasti integrácie transgénu spôsobili nestabilitu bunkovej línie. Budúci vývoj bunkovej línie sa môže zamerať na transgén do štrukturálne stabilných oblastí.

Autor: Qian Ye, Thu Phan, Wei-shou Hu, Xuping Liu, Li Fan, Wen-Song Tan, Liang Zhao.
Vírusy, 2021, 13 (11): 2200

Abstraktný
Bunková línia Madin -Darby Canine (MDCK) patrí medzi najbežnejšie používané bunkové línie na produkciu vakcín proti vírusu chrípky. Pretože výroba bunkovej kultúry je pripravená nahradiť procesy na báze vajec, zvyšovanie výroby vírusov je prvoradý význam. Aby sme objasnili faktory ovplyvňujúce produktivitu vírusu, izolovali sme sublín, H1, ktorý mal dvojnásobok chrípkového vírusu A (IAV) produktivity rodičovskej (P) klonovaním buniek a podrobne charakterizoval H1 a P podrobne na fyzických aj molekulárnych hladinách. Analýza transkriptómu odhalila, že v priebehu niekoľkých hodín po infekcii IAV predstavovali vírusové mRNA na jednej pätine celkovej mRNA, s niekoľkými vírusovými génmi vysoko exprimovanými H1 ako P. funkčná analýza dynamiky transkriptómu ukázala, že H1 a P reagovali podobne na infekciu IAV a boli podrobené infekcii hostiteľom a inflamárnym odpovediam. Dôležité je, že H1 bol aktívnejší pri translácii a RNA spracovanie vnútorne a po infekcii. Okrem toho mal H1 viac tlmené zápalové a antivírusové reakcie. Celkovo predpokladáme, že vysoká produktivita IAV závisí od rovnováhy medzi potlačením funkcií hostiteľa, aby sa odvrátili bunkové zdroje a udržanie dostatočných aktivít na replikáciu vírusov. Mechanistické poznatky o produktivite vírusu môžu uľahčiť optimalizáciu procesu a inžinierstvo bunkových línií na rozvoj výroby vakcíny proti chrípke.

Autor: Yanmin Zhang, Weijian Zhang, Jun Cheng, Xuping Liu, Shiwei Miao, Wen-Song Tan, Liang Zhao.
Appl Microbiol Biotechnol, 2022, 106: 3611-3623

Abstraktný
Vakcíny proti podjednotkám s vysokou čistotou a bezpečnosťou sa postupne stávajú hlavným trendom vakcinológie. Na zvýšenie imunitných reakcií podjednotkových vakcín v dôsledku ich zlej imunogenity sú však potrebné adjuvanty, ako je interferón-gama (IFN-). Konjugácia antigénu s adjuvansom môže vyvolať silnejšie imunitné reakcie v porovnaní so zmesou antigénu a adjuvansu. Zároveň je výber linkerov, ktorý je nevyhnutný pri konštrukcii stabilných a bioaktívnych fúznych proteínov, komplikovaný a časovo náročný. Vývoj imunoinformatických a štrukturálnych vakcinologických prístupov poskytuje prostriedok na riešenie vyššie uvedeného problému. Preto v tejto štúdii bol proteín IFN-fúz s optimálnym linkerom (e {5}} r {6}} PIFN) navrhnutý bioinformatickými prístupmi k zlepšeniu imunogenicity vírusu clasickej Swine (CSFV) E2 vakcínu. Okrem toho bol fúzny proteín E {8}} R 2- PIFN Fusion Protein exprimovaný v bunkách HEK293T a biologické účinky IFN- v E 2- R 2- PIFN boli potvrdené in vitro cez Western blotting. Tu sa použije alternatívna metóda na zjednodušenie konštrukcie a validácie fúzneho proteínu adjuvantného fúzie antigénu, čím poskytuje potenciálny kandidát na podjednotkovú vakcínu proti CSFV.

Autor: Zhang Y, Na D, Zhang W, Liu X, Miao S, Tan WS, Zhao L.
Vakcína. 2023, 41 (9): 1573-1583

Abstraktný
Vyžadujú sa veľké množstvá antigénov, pretože ochranné antigény, ako je napríklad proteín E2 vírusu klasickej ošípanej (CSFV) E2, sa široko používajú v diagnostických činidlách a podjednotkových vakcinároch. V porovnaní s klonálnymi bunkovými líniami a prechodnou génovou expresiou poskytujú stabilné bunkové skupiny potenciálnu alternatívnu platformu na rýchle produkovanie veľkého množstva antigénov. V tejto práci boli najprv bunkové skupiny ľudských embryonálnych obličiek (HEK293T) exprimujúce proteín E2 vyvinutými transdukciou lentivírusových vektorov. Na jednej strane bol SP7 vybraný zo 7 dobre výkonných signálnych peptidov, aby sa pozoruhodne zvýšila produkcia proteínu E2. Na druhej strane sa zistilo, že vysoká MOI môže zlepšiť expresiu proteínu E2 zvýšením počtu génových kópií. Okrem toho sa bunkové skupiny HEK293T hodnotili z hľadiska stability pasážami a dávkovými kultúrami, čo dokazuje, že bunkové skupiny boli stabilné najmenej 90 dní. A potom sa študoval výkon bunkových fondov v dávkach, šarži a poloperfúzii. Medzi nimi bol titer proteínu E2 až 2 g/l v semifúzii, ktorá je v súčasnosti najvyššia ako vedomosti autorov. Nakoniec sa agregácie a imunogenita proteínu E2 analyzovali pomocou SDS-PAGE a imunizáciou myší. V troch kultivačných metódach nebol významný rozdiel v agregáciách a titroch protilátok E2 proteínu. Tieto výsledky naznačujú, že stabilné bunkové skupiny HEK293T sú sľubnou a robustnou platformou pre rýchlu a účinnú produkciu rekombinantných proteínov.

Autor: Weiwei Zhang, Huimin Huang, Haibo Cai, Wen-Song Tan.
Bunková proliferácia, 2019, 52 (3): E12594

Abstraktný
Cieľ: Expanzia ex vivo je účinný spôsob, ako produkovať bunky zabíjania (CIK) indukované cytokínmi, ktoré sú potrebné na klinické skúšky. Tu sa skúmali expanzia ex vivo a metabolizmus buniek CIK v statických a dynamických kultúrach a vzťah medzi expanziou buniek a metabolizmom.
Materiály a metódy: Účinnosť prenosu kyslíka sa hodnotila technikou výpočtovej dynamiky tekutín. Bunkový fenotyp, apoptóza a expresia transportéra boli stanovené prietokovou cytometriou a westernovým blotom. Metabolity a enzýmové aktivity sa hodnotili biochemickými metódami.
Výsledky: Dynamické kultúry uprednostňovali lepšiu expanziu buniek CIK bez toho, aby narušili ich fenotyp a cytotoxicitu, zvýšenú účinnosť prenosu kyslíka. Tok glukózového metabolizmu buniek v dynamických kultúrach bol zvýšený zvýšením regulácie expresie transportéra 1 transportéra glukózy a fosfofruktokinázovej aktivity. Okrem toho sa metabolický tok pentózy fosfátu (PPP) zvýšil zvýšením regulácie aktivity glukózy -6 -fosfátu dehydrogenázy. Glutaminolýza sa tiež urýchlila zvýšením expresie transportérov glutamínu, glutaminázy (GLS) a aktivity glutamátu dehydrogenázy. Spolu s vyššou rýchlosťou spotreby kyslíka a rýchlosťou extracelulárnej acidifikácie sa navrhlo, že bunky v dynamických kultúrach boli na produkciu ATP v intenzívnejšom metabolickom stave.
Záver: Dynamické kultúry urýchlili metabolický tok glukózy a glutamínu na podporu produkcie ATP, zvýšený metabolický tok glukózy prostredníctvom PPP na podporu biosyntézy pre lepšiu expanziu buniek. Tieto zistenia môžu poskytnúť základ pre optimalizáciu procesu expanzie buniek ex vivo CIK.

Autor: Zhepei Xie, Yan Fu, Wen-Song Tan, Haibo Cai.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2021, 105 (10): 4285-4295

Abstraktný
Prírodné zabijáky -92 buniek (NK -92) sa musia účinne rozšíriť kultúrou bez séra in vitro, aby sa splnili klinické požiadavky. Mastné kyseliny poskytujú predovšetkým substráty na výrobu energie, čo má zásadný význam, že energetické požiadavky vysoko proliferujúcich buniek. Táto štúdia optimalizovala médium (EM) pre bunky NK {3}} navrhnutím experimentu na efektívne rozšírenie buniek. EM, interné chemicky definované médium bez séra, sa používalo ako základné médium. Mastné kyseliny ako prísady aditív boli skrínované a optimalizované experimentálnou návrhovou metódou. Skrínovali sa tri prísady, kyselina arachidónová, kyselina myristická a kyselina palmitoleová; Preto bolo optimalizované médium pomenované EM-FA. Celková expanzia buniek NK -92 v EM-FA bola 72,61 ± 11. Na preskúmanie mechanizmu, ktorým mastné kyseliny podporujú NK -92 expanziu buniek, sa analyzovali kinetika bunkového rastu a metabolické charakteristiky v EMFA. Výsledky ukázali, že bunky NK -92 v EM-FA sa rýchlo rozšírili pri zachovaní ich bunkového fenotypu a cytotoxicity a zvyšovali rýchlosť spotreby kyslíka a mitochondriálnu funkciu. Mastné kyseliny podporovali produkciu ATP na zvýšenie toku energie pre lepšiu expanziu buniek. Táto štúdia vyvinula expanznú stratégiu buniek -92 in vitro, aby sa uľahčila ich klinická aplikácia.

Autor: Jie Sun, Yan Zhou, Zhaoyang Ye, Wen-Song Tan
Research Tissue Research, 2019, 60 (4): 406-417

Abstraktný
Pozadie: Mezenchymálne kmeňové bunky (MSC) sú sľubné pre bunkovú terapiu a regeneratívnu medicínu. Je nevyhnutná zvýšená potreba rozšírenia MSC v stave bez séra, aby sa dosiahla dostatočné množstvo terapeutických aplikácií. Transformácia rastového faktora - 1 (TGF - 1) sa široko používa na rozširovanie klinických MSC in vitro. Táto práca sa zameriava na vplyv TGF - 1 na proliferáciu v MSC odvodených od kostnej drene potkanov (BMSC) a na základný mechanizmus.
Materiály a metódy: BMSC boli izolované a kultivované s alebo bez TGF - 1 v teste média bez séra a na detekciu proliferácie BMSC sa použila súprava BMSC. Analyzoval sa aj prechod bunkového cyklu. Ďalej, hladiny expresie cyklínu D1, fosforylovanej fokálnej adhéznej kinázy a downstream efektorov v signálnej dráhe AKT-MTOR-S6K1 sa skúmali westernovým prenosom.
Výsledky a záver: TGF - 1 Spustená proliferácia prostredníctvom urýchľovania prechodu bunkového cyklu G1/S v BMSC. Pridanie TGF - 1 môže aktivovať dráhu AKT-MTOR-S6K1. Okrem toho sa zistilo, že FAK je zapojený do procesu. Po pridaní inhibítora FAK sa zrušila aktivácia proliferácie buniek AKTMTOR-S6K1 a TGF - 1-. Spoločne pochopenie porozumenia o tom, ako sa dosiahne proliferácia TGF - 1. Táto štúdia poskytuje možnú stratégiu doplňovania TGF - 1 v médiu bez séra pre expanziu in vitro, ktorá by nakoniec podporila produkciu klinických MSC pre regeneratívnu medicínu.

Autor: Miaomiao Chai, CE GU, Qihua Shen, Jiaxing Liu, Yi Zhou, Ziyang Jin, Wanli Xiong, Yan Zhou, Wen-Song Tan.
Výskum a terapia kmeňových buniek, 2020, 11 (1): 343

Abstraktný
Pozadie a cieľ: Nedostatočná vaskularizácia je výzvou v inžinierstve kostného tkaniva, pretože vnútorné bunky sú náchylné na nekrózu kvôli nedostatku zásobovania živín. Mezenchymálne kmeňové bunky odvodené od potkanov (RBMSC) a endotelové bunky ľudskej pupočnej žily (HUVEC) sa kokultovali, aby sa konštruovali predaskularizované kostné tkanivo v osteogénnom indukčnom médiu (OIM) v vitro. Angiogénna kapacita HUVEC bola v kokultúrnom systéme obmedzená. V tejto štúdii sa analyzovali účinky zložiek v médiu na angiogenézu HUVEC.
Metódy: Kokultúrny systém bol stanovený v OIM. Na vyhodnotenie osteogénnej schopnosti MSC sa použili farbenie alizarínovej červenej farby a farbenie alkalickej fosfatázy. Na vyhodnotenie angiogénnej schopnosti HUVEC in vitro sa použil test matrigelovej trubice. Proliferácia HUVECS sa hodnotila pomocou počítania buniek a CCK -8 a migrácia bola vyhodnotená pomocou testu pruhovaného dosky. Hladiny expresie génov a proteínov spojených s angiogenézou v HUVEC boli merané QRT-PCR a Western blotting.
Výsledky: Dexametazón v OIM potlačil proliferáciu a migráciu HUVEC, čo inhibovalo tvorbu kapilárnych štruktúr. Náš výskum ukázal, že dexametazón stimuloval HUVEC, aby vylučoval inhibítor tkaniva metaloproteinázy (TIMP -3), ktorý konkuroval vaskulárnym endoteliálnym rastovým faktorom (VEGF-A) viažu na receptor vaskulárneho endoteliálneho rastového faktora 2 (VEGFR2, KDR). Tento účinok súvisel s inhibíciou fosforylácie ERK a AKT, ktoré sú dvoma downstream cieľmi KDR. Avšak pri hypoxii vylepšená expresia hypoxiainducibilného faktora -1 (hif -1) znížila expresiu TIMP -3 a podporovala fosforyláciu KDR, zlepšovala huvec angiogenézu v kokultúrnom systéme.
Záver: Kokultúra HUVEC a MSC s hypoxiou vykazovala v OIM robustnú angiogenézu a osteogenézu, čo má v budúcnosti dôležité dôsledky pre predškularizáciu v inžinierstve kostného tkaniva.

Autor: Wei Liu, Mi Zhang, Miaomiao Zhou, Ce Gu, Zhaoyang Ye, Yan Xiao, Yan Zhou, Meidong Lang, Wen-Song Tan.
Materials Science & Engineering C, 2020, 109 (c): 110523

Abstraktný
V prípade kultúry hepatocytov in vitro má povrchový znak využívaných lešení priamy vplyv na bunkovú adhéziu, rast a diferencovanú funkčnosť. Tu, na reguláciu rastu hepatocytov a diferencovanej funkčnosti, boli modifikované mikrofiblózne skafoldy vyrobené povrchovo štepením monoamínu ukončených laktobiónový laktón (L-NH (L-NH₂) a želatína na netkanom poly (etyléntereftaláte) (PET) vláknitého substrátu (PET-Gal a Petgel). Charakterizovali sa fyzikálno -chemické vlastnosti lešenia PET pred a po modifikácii. Po 15- dennej kultúre sa hodnotili účinky modifikovaných lešení PET na rast a diferencovanú funkčnosť ľudských hepatocytov (HIHEP) v porovnaní s funkciou kontroly bez modifikácie. Výsledky ukázali, že modifikácie L-NH2 aj želatíny zlepšili vlastnosti lešenia vrátane hydrofilnosti, pomeru absorpcie vody, tuhosti a drsnosti, čo viedlo k účinnej adhézii buniek, ~ 20- expanzie buniek a zvýšenej diferencovanej funkčnosti. After culture for 15 days, PET-Gal cultured cells formed aggregates, displaying better cell viability and significantly higher differentiated functionality regarding albumin secretion, urea synthesis, phases I (cytochrome P450, CYP1A1/2 and CYP3A4) and II (uridine 5′-diphosphate glucuronosyltransferases, UGT) enzyme activity, biliary excretion and detoxification ability (Eliminácia amoniaku a konjugácia bilirubínu) v porovnaní s kultivovanými PET a PET-GEL. Preto ako trojrozmerná (3D) mikrofibrózna skafoldová, PET-Gal podporuje rast hiheps a diferencovanú údržbu funkčnosti, ktorý sa sľubne využíva v bioartifických bioreaktoroch pečene (BAL).